近期，温州医科大学王周光、李校堃和武汉大学叶青松在科爱出版创办的期刊BioactiveMaterials上联合发表文章：Hypoxiaresponseelement-directedexpressionofbFGFindentalpulpstemcellsimprovethehypoxicenvironmentbytargetingpericytesinSCIrats。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)具多种神经促进作用，另外牙髓干细胞(DPSCs)具有免疫排斥反应较低，获取和储存容易等优点。本研究观察腺相关病*在缺氧反应元件调控下表达bFGF的DPSCs在脊髓损伤修复中的作用。移植后，DPSCs可分化为CD13+周细胞，上调N-cadherin的表达，促其与血管内皮细胞附着。二者的再附着随后通过突起的收缩增加了微血管中的血流速度，脊髓损伤局部缺氧微环境得到改善。1.研究内容简介
脊髓损伤(SCI)可导致长期的神经功能缺损，表现为损伤水平以下的运动、感觉和自主神经功能障碍。传统研究认为，SCI后血管破裂可引起炎症，包括缺血、血管痉挛和大量内出血。与此同时，需要高氧需求的神经元由于血液灌注不足而死亡。损伤后3天损伤区域就有微血管存在，在脊髓损伤的慢性期微血管密度增加到%。然而，微血管再生后脊髓损伤引起的缺氧微环境并未得到改善。因此，研究缓解脊髓损伤中枢缺氧的因素是治疗脊髓损伤的关键靶点之一。
由于中枢神经元的不可再现性，物理治疗、药物治疗、康复治疗等治疗方法对损伤神经功能的恢复效果不大。越来越多的证据表明，干细胞移植是一种潜在的治疗脊髓损伤的方法。然而，干细胞移植面临着各种挑战，包括细胞来源的伦理问题和临床试验中的免疫排斥。这里，我们选择牙髓干细胞(DPSCs)作为移植细胞来源。DPSCs具有高度增殖和多谱系分化的特点，可以作为自体移植。此外，DPSCs可以很容易地从新近拔除的牙中分离出来，而不会对健康造成不良影响。由于其分离方便、缺乏伦理争议和免疫原性低，使得DPSCs在临床上得到广泛应用。DPSCs具有高度克隆性、多种分化和神经血管特性。在特定条件下，DPSCs在体外和体内均能分化为成熟的神经元细胞。DPSCs已被证明在受损的中枢神经系统中具有巨大的再生潜能，在促进脊髓损伤后的功能恢复方面比骨髓间充质干细胞更有效。因此，DPSCs是一种很有前途的脊髓损伤移植治疗的候选者。bFGF被认为是SCI修复的候选分子。已有研究表明bFGF在神经系统的生长发育中起着重要作用。然而，当bFGF应用于SCI部位时，采用常用的给药方法，并没有达到治疗效果。其原因可能是移植的干细胞在SCI微环境中难以存活，导致bFGF无法通过促进干细胞增殖和分化介导SCI修复。因此，改善脊髓损伤后缺血缺氧微环境，联合bFGF与移植的DPSCs修复脊髓损伤成为我们研究的主要目标。
在本研究中，我们以腺相关病*(AAV)为载体，利用缺氧反应元件(HRE)介导人bFGF的表达，这可能为今后的临床试验铺平了道路。为此，我们制作了AAV-5HRE-bFGF-DPSCs并移植到脊髓损伤部位。通过检测血管相关蛋白N-钙粘蛋白(N-cadherin)、丙氨酰氨基肽酶(CD13)、血小板源性生长因子受体(PDGFR-β)和血小板内皮细胞粘附分子(CD31)的表达，探讨缺氧环境的缓解因素。以缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)为指标，观察缺氧的变化。以神经元核蛋白(NeuN)、神经调节蛋白(GAP43)和神经丝蛋白(NF)为指标，观察神经元数量和轴突再生情况。采用斜面试验、BBB量表、足迹分析和录像图像研究AAV-5HRE-bFGF-DPSCs在SCI大鼠运动功能恢复中的作用。我们的研究发现，AAV-5HRE-bFGF-DPSCs通过减轻缺氧微环境对SCI大鼠的损伤而具有治疗作用。
AAV-5HRE-bFGF-DPSCs作用示意图
我们生成了AAV-5HRE-bFGF构建物并将其转导到DPSCs中,染色结果表明，在DPSCs组中STRO-1的表达比例无统计学差异,DPSCs或CON-DPSCs组相比，bFGF-DPSCs组的bFGF表达以时间过程依赖的方式被缺氧环境诱导,AAV-5HRE-bFGF成功转染到DPSCs中，并仅在缺氧条件下表达bFGF。(Fig.1)
Fig.1.Preparation,characterizationanddifferentialdetectionofAAV-5HRE-bFGF-DPSCs.(A)Schematicdiagramsshowingthevectorconstruction:AAV-5HRE-bFGFandAAV-5HRE.(B)ImmunofluorescencestainingshowingSTRO-1(red)andbFGF(green)intheDPSCsgroup,CTRLgroupandbFGFgroupundernormoxicandhypoxicconditions.ThenucleusislabeledbyDAPI(blue).Magnification:10X;Scalebar:μm.(C)QuantitativeanalysesofimmunofluorescencestainingshowingthefluorescenceintensityofSTRO-1positivecellsundernormoxicandhypoxicconditions.(D)ThevirustransfectionrateofbFGF.(E)ComparisonoftThefluorescenceintensityofbFGFpositivecellsindifferentgroupsundernormoxicandhypoxicconditions.(F-G)ELISAresultsshowingbFGFreleaseconcentrationofDPSCsgroup,CTRLgroupandbFGFgroupundernormoxicandhypoxicconditions.ThenucleusislabeledbyDAPI(blue).Magnification:10X;Scalebar:μm.*representsP0.05.**representsP0.01.***representsP0..Dataarerepresentedasmean±SD(n=6).
AAV-5HRE-bFGF-DPSCs体内高水平表达bFGF,bFGF-DPSCs组的bFGF表达伴随着HIF-1α表达的降低。说明bFGF的表达受缺氧环境调控，可能参与促进了脊髓损伤大鼠缺氧环境的恢复。(Fig.2)
Fig.2.FunctionalverificationofAAV-5HRE-bFGF-DPSCsinvivo.(A)ImmunofluorescencestainingshowingHIF-1α(green)andbFGF(red)intheSham,SCIgroup,AAV-5HRE-DPSCs(CON-DPSCs)groupandAAV-5HRE-bFGF-DPSCs(bFGF-DPSCs)groupin30d.a.t.andbFGF-DPSCsgroupin14d.a.t..ThenucleusislabeledbyDAPI(blue).Magnification:40X;Scale:50μm.(B-C)ThefluorescenceintensityofHIF-1αandbFGFintheSham,SCIgroup,CON-DPSCsgroupandbFGF-DPSCsgroupin30d.a.t..(D-E)ThefluorescenceintensityofHIF-1αandbFGFin14and30d.a.t..(F)TheratioofHIF-1α+bFGF+cellsinbFGF+cellsin14and30d.a.t..*representsP0.05.**representsP0.01.***representsP0..n.s.representsnostatisticalsignificance.Dataarerepresentedasmean±SD(n=6).
采用免疫荧光染色在30天检测N-cadherin和CD31的表达，并用bFGF作为AAV-5HRE-bFGF-DPSCs的标记物。我们检测到SCI组CD31和N-cadherin的阳性率最高。同时，bFGF-DPSCs组的CD31和N-cadherin阳性率明显低于SCI组和CON-DPSCs组(图3A-C)。表达N-cadherin的细胞不共表达CD31，但部分共表达bFGF(N-cadherin+bFGF+细胞)进行进一步分析。可见，bFGF-DPSCs组的bFGF+细胞中N-cadherin的表达率明显高于其他组，且N-cadherin+和bFGF+细胞位于血管周围。(Fig.3)
Fig.3.AnalysisoftherelationshipbetweenAAV-5HRE-bFGF-DPSCsandvascularendothelialcells.(A)ImmunofluorescencestainingshowingtheexpressionofN-cadherin(green),bFGF(red)andCD31(purple)intheSham,SCIgroup,AAV-5HRE-DPSCs(CON-DPSCs)groupandAAV-5HRE-bFGF-DPSCs(bFGF-DPSCs)groupatday30.ThenucleusislabeledbyDAPI(blue).Magnification:20X;Scale:μm.(B-C)ComparisonofthefluorescenceintensityofN-cadherinandCD31ofpositivecells(relativetoSCIgroup).(D-G)TheratioofdifferentcellsintheSham,SCIgroup,AAV-5HRE-DPSCs(CON-DPSCs)groupandAAV-5HRE-bFGF-DPSCs(bFGF-DPSCs)group.*representsP0.05.**representsP0.01.***representsP0..n.s.representsnostatisticalsignificance.Dataarerepresentedasmean±SD(n=6).
根据免疫荧光染色,内皮细胞用CD31进行标记，DPSCs移植组CD31表达没有显著差异,但显著高于假手术组和SCI组(图4A、B)，表达N-cadherin的细胞部分与CD13+周细胞共定位，而与CD31+内皮细胞不共定位，提示N-cadherin是由CD13+周细胞分泌的，CD13+周细胞的表达在空间分布上有差异，可分为周围内皮细胞(α区)和散在分布(β区)。为进一步探讨CD13+周细胞在不同区域的N-cadherin表达，我们分析了CD13+周细胞在α和β区域的N-cadherin表达。在α区域CD13+周细胞分泌N-cadherin的比例是假手术组最高,其次是bFGF-DPSCs组,SCI组最低。相比之下,SCI组，CON-DPSCs组和bFGF-DPSCs组三组表达N-cadherin的CD13+周细胞的比例也同样低，这些数据表明，N-cadherin可能在帮助CD13粘附内皮细胞中发挥重要作用。(Fig.4)
Fig.4.CD13+pericytesrelyonN-cadherintoattachtovascularendothelialcells
(A)ImmunofluorescencestainingshowingtheexpressionofCD31(green),CD13(red)andN-cadherin(blue)intheSham,SCIgroup,AAV-5HRE-DPSCs(CON-DPSCs)groupandAAV-5HRE-bFGF-DPSCs(bFGF-DPSCs)group.α1andβ1representthefittingofCD31andN-cadherin.α2andβ2representthefittingofCD13andN-cadherin.α3andβ3representthefittingofCD31,CD13andN-cadherin(greenbe
